W eksperymentach PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) opakowanie może wydawać się proste, ale bezpośrednio wpływa na stabilność odczynnika, łatwość użycia i wiarygodne wyniki. Niezależnie od tego, czy przechowywanie i transport laboratorium - przygotowane odczynniki lub premiks komercyjny, opanowanie odpowiednich technik pakowania PCR może uniknąć typowych błędów i poprawić wydajność eksperymentalną. Poniżej dzielimy praktyczne wskazówki dotyczące wyboru materiałów, strategii pakowania i szczegółów przechowywania.
I. Wybór materiałów opakowania: priorytetyzowanie kompatybilności i ochrony
Reakcje PCR są wrażliwe na temperaturę, światło i zanieczyszczenia, więc materiały opakowaniowe muszą spełniać trzy kluczowe wymagania: Airtightness, Light - dowód i bezwładność chemiczna.
W przypadku rur odśrodkowych i płytek PCR preferowany jest polipropylen (PP), ze względu na jego wysoką przezroczystość i dnase/rnase - wolne właściwości . 0.2 ml cienkie - rurki PCR są idealne do szybkiego przeniesienia ciepła, podczas gdy 0,5 ml rurek jest lepsze do przechowywania skoncentrowanych regijnych. W przypadku 96 - Well PCR zalecamy wybór spódnicy (dla ułatwienia robotycznej manipulacji) lub nie-spódnicy (do ochrony przestrzeni).
Metoda uszczelnienia: Konwencjonalne rurki wirówki wykorzystują płaskie lub podniesione czapki (aby zapobiec odparowaniu i wysuszeniu). Jednak dla długiego przechowywania terminu - Film uszczelniający ogrzewanie - (taki jak parafilm) lub folia oddychająca (taka jak aeraseal) w celu równoważenia ciśnienia wewnętrznego i zewnętrznego. Płytki PCR są zalecane do używania kleju uszczelniacze folii aluminiowej (High - odporna na temperaturę) lub self - folia adhezyjna (dla single - użycie).
Ochrona światła: odczynniki zawierające światło - należy zastosować wrażliwe składniki (takie jak niektóre barwniki lub startery) należy zastosować folią aluminiową lub czarne płyty PCR (dostępne od niektórych producentów).
Ii. Techniki śluzowe: minimalizacja strat z powtarzanego zamrażania - cykli rozmrażania
Odczynniki podwielokrotności są podstawowym krokiem w opakowaniu PCR i bezpośrednio wpływa na eksperymentalną odtwarzalność.
Master Mix Aliquoting: Commercial Master Mixes (takie jak enzym Taq i mieszanka DNTP) są zalecane jako margines 10% -} 10%-. Unikaj używania bezpośrednio z opakowań masowych, ponieważ powtarzane cykle odwilku - mogą prowadzić do zmniejszonej aktywności enzymu (enzym TAQ może stracić około 5% aktywności na cykl zamrożenia i rozmrażanie).
Startery i szablony: Zaleca się, aby startery (zwłaszcza startery niestandardowe) są przyciągane ze 100 μm roztworów magazynowych i przechowywane w - 20 stopni. Rozcieńcz do stężenia roboczego (zwykle 0,1–1 μm) przed użyciem. Szablony, takie jak genomowy DNA, należy unosić się w pojedynczych ilościach -, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Wskazówki dotyczące zapobiegania zanieczyszczeniom: Zapewniają suche rurki wirówki przed poradowaniem (resztkowy etanol może hamować PCR), pre - chłodne porady pipety, aby zapobiec przyklejeniu zimnych odczynników do ściany, i nosić rękawiczki w całym procesie, aby uniknąć zanieczyszczenia DNA skóry.
Iii. Etykietowanie i rejestrowanie: Unikaj pułapki „czarnej skrzynki”
Wyraźne etykietowanie ma kluczowe znaczenie dla opakowania PCR; Nieprawidłowe znakowanie może zrujnować cały eksperyment.
Obowiązkowe informacje o znakowaniu: Nazwa odczynnika (np. „2 × Mastermix Taq”), stężenie/zawartość (np. „10 mm dntps”), numer partii (dla identyfikowalności), warunki przechowywania (np. „-20 stopni chronione przed światłem”), datę Aliquot i datę wydechu (np. EG, „Użycie w ciągu 6 miesięcy”).
Etykietowanie specjalne: Jeśli odczynnik zawiera glicerol (antyfreeze), barwniki (np. Zielone SYBR) lub dodatki (np. BSA), należy podać dodatkowe informacje (np. „Zawiera 50% glicerolu, nie przechowuj w wysokich temperaturach”).
Synchronizacja rekordu: Zaleca się użycie arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do zarządzania laboratorium (np. Labguru) do rejestrowania szczegółowych parametrów zawartości każdej rurki (np. Sekwencja startera, wartość TM) i powiązanie ich z fizycznym numerem etykiety.
Iv. Przechowywanie i transport: równoważenie temperatury i ochrony fizycznej
Stabilność odczynników PCR jest wysoce zależna od warunków przechowywania, a podczas transportu wymagana jest dodatkowa ochrona.
Ogólne przechowywanie:
Enzymes (Taq, odwrotna transkrypt): Long - przechowywanie terminu na - 20 stopni (Unikaj powtarzanych cykli zamrażania -rozmrażania; aliquot i przechowywanie o -80 stopni do przyszłego użycia);
Startery/sondy: przechowuj w wysokości -20 stopnia przez ponad 1 rok (jeśli zawiera zmodyfikowaną grupę, taką jak biotyna, chronić przed światłem);
Non - bufory enzymatyczne (np. PBS): Short - przechowywanie na 4 stopnie (do 1 miesiąca).
Wymagania transportowe:
Do transportu łańcucha chłodniczego użyj suchego lodu (- 78 stopni) dla enzymów (utrzymywanych poniżej -20 stopni) i niebieskiego lodu (około 0 stopni) dla buforów do transportu krótkoterminowego.
Unikaj nadmiernych wibracji (płytki PCR powinny być zabezpieczone w piankach, aby zapobiec mieszaniu odczynników między studzienkami).
Podczas wysokich letnich temperatur dodawaj warstwę izolacyjną do opakowania (np. Torba izolacyjna folii aluminiowej + zamrożony paczka żelowa).
V. Typowe problemy i rozwiązania
Problem 1: Opady opadu odczynnika (np. DNTPS lub opady MGCL₂ w niskich temperaturach) → Roztwór: Krótko wirówki (1000 obr / min, 1 minuta) przed alkoholem. Rozpuść się w inkubatorze 37 stopni przed użyciem i wiru, aby dokładnie wymieszać.
Problem 2: Uszczelniacz płytki łatwo odłącza → Rozwiązanie: Wybierz odporną uszczelniacz ogrzewania - z podkładem klejącym lub użyj uszczelniacza ciepła (odpowiedniego do eksperymentów przepustowości o wysokiej -).
Problem 3: Rozmyte etykiety → Rozwiązanie: Użyj wodoodpornego znacznika (takiego jak Sharpie) lub Laser - etykiety drukowane, aby zapobiec usuwaniu pisma odręcznego przez alkohol.
Wniosek
Opakowanie PCR to coś więcej niż tylko „opakowanie” odczynników; Jest to pierwsza linia obrony dla eksperymentalnej niezawodności. Wybierając odpowiednie materiały, standaryzację procesu usiadowania, utrzymanie dokładnego znakowania i utrzymanie ścisłej kontroli temperatury podczas transportu, możesz znacznie zmniejszyć błędy ludzkie, zapewniając bardziej stabilne reakcje amplifikacji i bardziej wiarygodne wyniki. Pamiętaj: Szczegóły określają sukces. Właściwe praktyki pakowania PCR mogą zaoszczędzić znaczne rozwiązywanie problemów w całym eksperymencie!